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医院污水检测

简要描述:

医院污水是指医院(综合医院•●、专业病院及其它类型医院)向自然环境或城市管道排放的污水。其水质随不同的医院性质•●、规模和其所在地区而异。每张病床每天排放的污水量约为200-1000L。医院污水中所含的主要污染物为:病原体(寄生虫卵•●、病原菌•●、病毒等)•●、有机物•●、漂浮及悬浮物•●、放射性污染物等░,未经处理的原污水中含菌总量达10^8个/mL以上。

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医院污水检测方法

  1. 粪大肠菌

A1  仪器和设备

A1.1 高压蒸汽灭菌器。

A1.2 干燥灭菌箱。

A1.3 培养箱:37℃。

A1.4 恒温水浴箱。

A1.5 电炉。

A1.6 天平。

A1.7 灭菌平皿。

A1.8 灭菌刻度吸管。

A1.9 酒精灯

A2  培养基和试剂

A2.1 乳糖胆盐培养液

A2.1.1成分

蛋白胨                         20g

猪胆盐(或牛•●、羊胆盐)         5g

乳糖                           5g

0.4%溴甲酚紫水溶液            2.5mL

蒸馏水                         1000mL

A2.1.2 制法

将蛋白胨•●、猪胆盐及乳糖溶解于1000mL蒸馏水中░,调整pH到7.4░,加入指示剂░,充分混匀░,分装于内有倒管的试管中。115℃下灭菌20min。贮存于冷暗处备用。

A2.2 三倍浓度乳糖胆盐培养液

A2.2.1成分

蛋白胨                         60g

猪胆盐(或牛•●、羊胆盐)         15g

乳糖                           15g

0.4%溴甲酚紫水溶液            7.5mL

蒸馏水                         1000mL

A2.2.2 制法

制法同附录A2.1.2。

A2.3 伊红美兰培养基(EMB培养基)

A2.3.1 成分

蛋白胨                          10g

       乳糖                            10g

       磷酸氢二钾                      2g  

       琼脂                            20g

       2%伊红水溶液                   20mL

       0.5%美蓝水溶液                 13mL

       蒸馏水                          1000mL

A2.3.2 制法

将琼脂加到900mL蒸馏水中░,加热溶解░,然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨░,混匀使溶解░,再加入蒸馏水补足至1000mL░,调整pH至7.2~7.4。趁热用脱脂棉和砂布过滤░,再加入乳糖░,混匀░,定量分装于烧瓶内░,115℃灭菌20min。作为储备培养基贮存于冷暗处备用。

临用时░,加热融化储备培养基░,待冷至60℃左右░,根据烧瓶内培养基的容量░,加入一定量的已灭菌的2%伊红水溶液和0.5%美蓝水溶液░,充分摇匀(防止产生气泡)。倾注平皿备用。

A2.4 乳糖蛋白胨培养液

A2.4.1成分

蛋白胨                         10g

                         3g

乳糖                           5g

氯化钠                         5g

1.6%溴甲酚紫乙醇溶液          1mL

蒸馏水                         1000mL

A2.4.2 制法

将蛋白胨•●、•●、乳糖及氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中░,调整pH到7.2~7.4░,加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL░,充分混匀░,分装于内有倒管的试管中。115℃下灭菌20min。贮存于冷暗处备用。

A2.5 革兰氏染色液

A2.5.1 结晶紫染色液

结晶紫                         1g

95%乙醇溶液                   20mL

1%草酸铵水溶液                1000mL

将结晶紫溶于乙醇中░,然后与草酸铵水溶液混合。

A2.5.2 革兰氏碘液

碘                             1g

碘化钾                         2g

蒸馏水                         300mL

将碘与碘化钾混合░,加入蒸馏水少许░,充分摇匀░,待完全溶解░,再加入蒸馏水至300mL。

A2.5.3 脱色液

95%乙醇。

A2.5.4 沙黄复染液

沙黄                           1g

95%乙醇                       2g

蒸馏水                         90mL

将沙黄溶于95%乙醇中░,然后用蒸馏水稀释。

A2.6 染色法

染色的基本步骤为:1)涂片:在载玻片上滴加一滴生理盐水░,用灭菌的接种环取菌落少许░,与生理盐水混匀░,涂布成薄膜;2)干燥:在室温中使自然干燥;3)固定:将涂片迅速通过火焰2~3次░,以载玻片反面接触皮肤░,热而不烫为度;4)染色:滴加结晶紫染色液░,染色1min░,水洗;5)媒染:滴加革兰氏碘液░,作用1min░,水洗;6)脱色:滴加95%乙醇脱色░,约30s░,水洗;7)复染:滴加复染液░,复染1min░,水洗。

革兰氏阳性菌染色后呈紫色░,革兰氏阴性菌染色后呈红色。

注:亦可用1:10稀释的石炭酸复红染色液作复染剂░,复染时间为10s。

A3  检验程序

检验程序见图A 

http://www.chinacitywater.org/images/picsff3165p.jpg

A4  操作步骤

A4.1 样品准备

A4.1.1 污水

污水样品应至少取200mL░,使用前应充分混匀。

根据预计的污水样品中粪大肠菌数确定污水样品接种量。粪大肠菌数量相对较少的接种量一般为10mL•●、1mL•●、0.1mL。粪大肠菌数较多时接种量为1mL•●、0.1mL•●、0.01mL或0.1mL•●、0.01mL•●、0.001mL等。

接种量少于1mL时░,水样应制成稀释样品后供发酵试验使用。接种量为0.1mL•●、0.01mL时░,取稀释比分别为1:10•●、1:100。其它接种量的稀释比依此类推。

1:10稀释样品的制作方法为:吸取1mL水样░,注入到盛有9mL灭菌水的试管中░,混匀░,制成1:10稀释样品。因此░,取1mL1:10稀释样品░,等于取0.1mL污水样品。其它稀释比的稀释样品同法制作。

1:若样品为经过氯消毒的污水░,应在采样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。

A4.1.2 污泥

污泥样品应至少取200g░,使用前应充分混匀。

根据预计的污泥样品中粪大肠菌数量确定污泥样品接种量。粪大肠菌数量相对较少的污泥样品接种量一般为0.1g•●、0.01g•●、0.001g。粪大肠菌数量较多时接种量为0.01g•●、0.001g•●、0.0001g或0.001g•●、0.0001g•●、0.00001g等。

污泥样品应制成稀释样品后供发酵试验使用。接种量0.1g•●、0.01g•●、0.001g的稀释样品制作方法如下:取20g污泥样品░,加入到三角烧瓶中░,加灭菌水使成200mL░,混匀░,制成1:10稀释样品。吸取1:10稀释样品1mL░,注入到盛有9mL灭菌水的试管中░,混匀░,制成1:100稀释样品。按同法制成1:1000稀释样品。接种1mL1:10•●、1:100•●、1:1000稀释样品等于接种0.1g•●、0.01g•●、0.001g污泥样品。

1:若样品为经过氯消毒的污泥░,应在采样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。

A4.2 发酵试验

将样品接种于装有乳糖胆盐培养液的试管(内有小倒管)中░,44℃培养24h。样品接种体积以及管内乳糖胆盐培养液的浓度与体积根据以下条件确定:

样品为污水时░,取三个接种量•●、每个接种量的样品分别接种于5个试管内░,共需15个试管。试管内乳糖胆盐培养液的浓度与体积应根据接种量确定。若接种量为10mL░,吸取10mL样品接种于装有5mL三倍浓度乳糖胆盐培养液的试管内;若接种量为1mL时░,吸取1mL样品接种于装有10mL普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内;若接种量少于1mL时░,吸取1mL稀释样品接种于装有10mL普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内。

样品为污泥时░,取三个接种量•●、每个接种量的稀释样品分别接种于3个试管内░,共需9个试管。9个试管中░,各装有10mL乳糖胆盐培养液。各个试管接种稀释样品体积均为1mL。

A4.3 平板分离

大肠杆菌分解乳糖产酸时培养液变色•●、产气时小倒管内出现气泡。经24h培养后░,将产酸的试管内培养液分别划线接种于EMB培养基上。置于37℃培养箱中░,培养18~24h。

A4.4 鉴定

挑选可疑粪大肠菌菌落░,进行革兰氏染色和镜检?梢删溆校1)深紫黑色░,具有金属光泽的菌落;2)紫黑色░,不带或略带金屑光泽的菌落;3)淡紫红色░,中心色较深的菌落。

上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢杆菌░,则挑取上述典型菌落1~3个接种于盛有5mL乳糖蛋白胨培养液倒管和倒管的试管内░,置于44℃培养箱中培养24h。产酸产气试管为粪大肠菌阳性管。

A5 计数

根据证实有粪大肠菌存在的阳性管数░,查表A1A2可得100mL污水或1g污泥中粪大肠菌MPN值。

由于表A1和表A2是按一定的三个10倍浓度差接种量设计的(污水接种量为10mL•●、1mL和0.1mL░,污泥接种量为0.1g•●、0.01g和0.001g)░,当采用其他三个10倍浓度差接种量时░,需要修正表内MPN值░,具体方法如下:

表内所列污水(污泥)最大接种量增加10倍时表内MPN值相应降低10倍;污水(污泥)最大接种量减少10倍时表内MPN值相应增加10倍。如污水接种量改为1mL•●、0.1mL和0.01mL时░,A1表内MPN值相应增加10倍。其它的三个10倍浓度差接种量的MPN值相应类推。

由于A1表内MPN值的单位为每100mL污水样品中MPN值░,而污水以1L为报告单位░,因此需将查A1表得到的MPN值乘上10░,换算成1L污水样品中的MPN值。

 

表A1 污水中粪大肠菌最可能数(MPN)检索表

(污水样品接种量为510mL水样░,51mL水样和50.1mL水样)

阳性管数

100mL水样中MPN

阳性管数

100mL水样中MPN

阳性管数

100mL水样中MPN

 

接种100mL水样

接种10mL水样

接种0.1mL水样

接种100mL水样

接种10mL水样

接种0.1mL水样

接种100mL水样

接种10mL水样

接种0.1mL水样

 

0

0

0

0

2

0

0

5

4

0

0

13

 

0

0

1

2

2

0

1

7

4

0

1

17

 

0

0

2

4

2

0

2

9

4

0

2

21

 

0

0

3

5

2

0

3

12

4

0

3

25

 

0

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4

7

2

0

4

14

4

0

4

30

 

0

0

5

9

2

0

5

16

4

0

5

36

 

0

1

0

2

2

1

0

7

4

1

0

17

 

0

1

1

4

2

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9

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1

1

21

 

0

1

2

6

2

1

2

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2

26

 

0

1

3

7

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1

3

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3

31

 

0

1

4

9

2

1

4

17

4

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36

 

0

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5

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2

1

5

19

4

1

5

42

 

0

2

0

4

2

2

0

9

4

2

0

22

 

0

2

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6

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2

1

12

4

2

1

26

 

0

2

2

7

2

2

2

14

4

2

2

32

 

0

2

3

9

2

2

3

17

4

2

3

38

 

0

2

4

11

2

2

4

19

4

2

4

44

 

0

2

5

13

2

2

5

22

4

2

5

50

 

0

3

0

6

2

3

0

12

4

3

0

27

 

0

3

1

7

2

3

1

14

4

3

1

33

 

0

3

2

9

2

3

2

17

4

3

2

39

 

0

3

3

11

2

3

3

20

4

3

3

45

 

0

3

4

13

2

3

4

22

4

3

4

52

 

0

3

5

15

2

3

5

25

4

3

5

59

 

0

4

0

8

2

4

0

15

4

4

0

34

 

0

4

1

9

2

4

1

17

4

4

1

40

 

0

4

2

11

2

4

2

20

4

4

2

47

 

0

4

3

13

2

4

3

23

4

4

3

54

 

0

4

4

15

2

4

4

25

4

4

4

62

 

0

4

5

17

2

4

5

28

4

4

5

69

 

0

5

0

9

2

5

0

17

4

5

0

41

 

0

5

1

11

2

5

1

20

4

5

1

48

 

0

5

2

13

2

5

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23

4

5

2

56

 

0

5

3

15

2

5

3

26

4

5

3

64

 

0

5

4

17

2

5

4

29

4

5

4

72

 

0

5

5

19

2

5

5

32

4

5

5

81

 

阳性管数

100mL水样中MPN

阳性管数

100mL水样中MPN

阳性管数

100mL水样中MPN

 

接种100mL水样

接种10mL水样

接种0.1mL水样

接种100mL水样

接种10mL水样

接种0.1mL水样

接种100mL水样

接种10mL水样

接种0.1mL水样

 

 

 

1

0

0

2

3

0

0

8

5

0

0

23

 

1

0

1

4

3

0

1

11

5

0

1

31

 

1

0

2

6

3

0

2

13

5

0

2

43

 

1

0

3

8

3

0

3

16

5

0

3

58

 

1

0

4

10

3

0

4

20

5

0

4

76

 

1

0

5

12

3

0

5

23

5

0

5

95

 

1

1

0

4

3

1

0

11

5

1

0

33

 

1

1

1

6

3

1

1

14

5

1

1

46

 

1

1

2

8

3

1

2

17

5

1

2

63

 

1

1

3

10

3

1

3

20

5

1

3

84

 

1

1

4

12

3

1

4

23

5

1

4

110

 

1

1

5

14

3

1

5

27

5

1

5

130

 

1

2

0

6

3

2

0

14

5

2

0

49

 

1

2

1

8

3

2

1

17

5

2

1

70

 

1

2

2

10

3

2

2

20

5

2

2

94

 

1

2

3

12

3

2

3

24

5

2

3

120

 

1

2

4

15

3

2

4

27

5

2

4

150

 

1

2

5

17

3

2

5

31

5

2

5

180

 

1

3

0

8

3

3

0

17

5

3

0

79

 

1

3

1

10

3

3

1

21

5

3

1

110

 

1

3

2

12

3

3

2

24

5

3

2

140

 

1

3

3

15

3

3

3

28

5

3

3

180

 

1

3

4

17

3

3

4

32

5

3

4

210

 

1

3

5

19

3

3

5

36

5

3

5

250

 

1

4

0

11

3

4

0

21

5

4

0

130

 

1

4

1

13

3

4

1

24

5

4

1

170

 

1

4

2

15

3

4

2

28

5

4

2

220

 

1

4

3

17

3

4

3

32

5

4

3

280

 

1

4

4

19

3

4

4

36

5

4

4

350

 

1

4

5

22

3

4

5

40

5

4

5

430

 

1

5

0

13

3

5

0

25

5

5

0

240

 

1

5

1

15

3

5

1

29

5

5

1

350

 

1

5

2

17

3

5

2

32

5

5

2

540

 

1

5

3

19

3

5

3

37

5

5

3

920

 

1

5

4

22

3

5

4

41

5

5

4

1600

 

1

5

5

24

3

5

5

45

5

5

5

>1600

 

表A2 污泥中粪大肠菌最可能数(MPN)检索表

(污泥样品接种量为30.1g泥样░,30.01g泥样和30.001g泥样)

阳性管数

1g泥样中MPN

阳性管数

1g泥样中MPN

阳性管数

1g泥样中MPN

接种0.1 g污样管

接种0.01 g污样管

接种0.001 g污样管

接种0.1 g污样管

接种0.01 g污样管

接种0.001 g污样管

接种0.1 g污样管

接种0.01 g污样管

接种0.001 g污样管

0

0

0

<3

1

2

0

11

3

0

0

23

0

0

1

3

1

2

1

15

3

0

1

39

0

0

2

6

1

2

2

20

3

0

2

64

0

0

3

9

1

2

3

24

3

0

3

95

0

1

0

3

1

3

0

16

3

1

0

43

0

1

1

6.1

1

3

1

20

3

1

1

75

0

1

2

9.2

1

3

2

24

3

1

2

120

0

1

3

12

1

3

3

29

3

1

3

160

0

2

0

6.2

2

0

0

9.1

3

2

0

93

0

2

1

9.3

2

0

1

14

3

2

1

150

0

2

2

12

2

0

2

20

3

2

2

210

0

2

3

16

2

0

3

26

3

2

3

290

0

3

0

9.4

2

1

0

15

3

3

0

240

0

3

1

13

2

1

1

20

3

3

1

460

0

3

2

16

2

1

2

27

3

3

2

1100

0

3

3

19

2

1

3

34

3

3

3

>1100

1

0

0

3.6

2

2

0

21

 

 

 

 

1

0

1

7.2

2

2

1

28

 

 

 

 

1

0

2

11

2

2

2

35

 

 

 

 

1

0

3

15

2

2

3

42

 

 

 

 

1

1

0

7.3

2

3

0

29

 

 

 

 

1

1

1

11

2

3

1

36

 

 

 

 

1

1

2

15

2

3

2

44

 

 

 

 

1

1

3

19

2

3

3

53

 

 

 

 

A6  检验结果报告

根据粪大肠菌MPN值░,报告1L污水或1g污泥样品中粪大肠菌MPN值。

3.2肠道致病菌

3.2.1医疗机构污水和污泥中沙门氏菌的检验(附录B)

  B1 仪器和设备

  B1.1高压蒸汽灭菌器。

  B1.2干燥灭菌箱。

  B1.3培养箱。

  B1.4恒温水浴箱。

  B1.5电炉。

  B1.6天平。

  B1.7灭菌平皿。

  B1.8 灭菌刻度吸管。

  B1.9 酒精灯。

  B2 培养基和试剂

  B2.1 盐增菌液(SF增菌液)

  B2.1.1 成分

  胰蛋白胨(或多价胨) 10g

  磷酸氢二钠(Na2HPO3) 16g

  磷酸二氢钠(NaH2PO3) 2.5g

  乳 糖 4g

   4g

  蒸馏水 1000mL

  B2.1.2 制法

  除外░,将以上各成分放入蒸馏水中░,加热溶化。再加入░,待完全溶解后░,调整pH到7.0~7.1░,分装于三角烧杯内。121℃下灭菌15min备用。

  B2.2 二倍浓度盐增菌液(二倍浓度SF增菌液)

  B2.2.1 成分

  除蒸馏水改为500mL外░,其它成分同附录B2.1.1.

  B2.2.2 制法

  制法同附录B2.1.2.

  B2.3 SS培养基

  B2.3.1 基础培养基

  B2.3.1.1 成分

   5g

  示胨 5g

  三号胆盐 3.5g

  琼脂 17g

  蒸馏水 1000mL

  B2.3.1.2 制法

  将•●、示胨和胆盐溶解于400mL蒸馏水中。将琼脂加到600mL蒸馏水中░,煮沸使其溶解。再将二者混合░,121℃下灭菌15min░,保存备用。

  B2.3.2 完成培养基

  B2.3.2.1 成分

  基础培养基 1000mL

  乳糖 10g

  柠檬酸钠 8.5g

  硫代硫酸钠 8.5g

  10%柠檬酸铁溶液 10mL

  1%中性红溶液 2.5mL

  0.1%煌绿溶液 0.33mL

  B2.3.2.2 制法

  加热溶化基础培养基░,按比例加入除中性红和煌绿溶液以外的各成分░,充分混合均匀░,调整pH到7.0░,加入中性红和煌绿溶液░,倾注平板。

  注:制好的培养基宜当日使用░,或保存于冰箱内于18h内使用。煌绿溶液配好后应在10天以内使用。

  B2.4 亚硫酸铋琼脂培养基(BS培养基)

  B2.4.1 基础培养基

  B2.4.1.1 成分

  蛋白胨 10g

   5g

  氯化钠 5g

  琼脂 20g

  蒸馏水 1000mL

  B2.4.1.2 制法

  加热溶解各成分░,按每份100mL的量分装于250mL三角瓶中░,121℃下灭菌20min备用。

  B2.4.2 亚硫酸铋贮备液

  B2.4.2.1 成分

  柠檬酸铋铵 2g

  亚硫酸钠 20g

  磷酸氯二钠 10g

  葡萄糖 10g

  蒸馏水 200mL

  B2.4.2.2 制法

  将柠檬酸铋铵溶解于50mL沸水中░,同时将压硫酸钠溶解于100mL沸水中░,混合两液并煮沸3min░,趁热加入磷酸氯二钠搅拌至溶解。冷却后░,加入剩余的50mL葡萄糖水溶液░,贮存于冰箱中。

  B2.4.3 柠檬酸铁煌绿贮备液

  B2.4.3.1 成分

  柠檬酸铁 2g

  煌绿(1%水溶液) 25mL

  蒸馏水 200mL

  B2.4.3.2 制法

  将上述成分溶解于水中░,盛于已灭菌的玻璃瓶内░,贮存于冰箱。

  B2.4.4 完成培养基

  B2.4.4.1 成分

  基础培养基 100mL

  亚硫酸铋贮备液 20mL

  柠檬酸铁煌绿贮备液 4.5mL

  B2.4.4.2 制法

  加热融化基础培养基并冷却至50℃░,同时分别加热亚硫酸铋贮备液和柠檬酸铁煌绿贮备液至50℃。在无菌操作下将后者加入到前者去░,充分混合░,无菌倾入已灭菌的培养皿中。

  B2.5 三糖铁琼脂培养基(TSI培养基)

  B2.5.1成分

  蛋白胨 20g

   5g

  乳糖 10g

  蔗糖 10g

  葡萄糖 1g

  氯化钠 5g

  硫酸亚铁铵 0.2g

  硫代硫酸钠 0.2g

  琼脂 12g

  酚红 0.025g

  蒸馏水 1000mL

  B2.5.2 制法

  将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中░,调pH到7.4.加入琼脂░,加热煮沸░,再加入0.2%酚红水溶液12.5mL░,摇匀。分装试管░,装量宜多些░,以便得到较高的底层。121℃下灭菌15min.放置高层斜面备用。

  B2.6 沙门氏菌诊断血清

  B3 检验程序

检验程序见图B

  B4 操作步骤

  B4.1 样品处理和增菌

  B4.1.1 污水

  取200mL污水░,用灭菌滤膜进行抽滤。用100mL二倍浓度SF增菌液把滤膜上截留的杂质洗脱到灭菌三角烧瓶内░,充公摇匀░,置于37℃恒温培养箱░,增菌培养12~24h.

  注:若样品为经过氯消毒的污水░,应在采样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。

  B4.1.2 污泥

  用灭菌匙称取污泥20g░,放入灭菌容器内░,加入200mL灭菌水░,充分混匀░,制成1:10混悬液。吸取上述1:10混悬液100mL░,加入到装有100mL二倍浓度SF增菌液的已灭菌的三角烧瓶内░,摇匀░,置于37℃恒温培养箱░,增菌培养24h.

  注:若样品为经过氯消毒的污泥░,应在采样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。

  B4.2 平板分离

  取上述增菌培养液░,分别接种于SS培养基平板和BS培养基平板░,置于37℃培养箱中░,培养24~48h.观察各平板上生长的菌落形态。

  挑取在SS培养基平板上呈无色透明或中间有黑心░,直径1~2mm的菌落;挑取在BS培养基平板上呈黑色的菌落或灰绿色的可疑肠道病原菌菌落。每个平板最少挑取5个菌落░,接种于TSI培养基中░,置于37℃培养箱中░,培养18~24h.

  B4.3 鉴定

  B4.3.1 血清学试验

  在TSI培养基中░,如不发酵乳糖░,发酵葡萄糖产酸产气或只产酸不产气░,一般产生硫化氢░,有动力者░,先与沙门氏A-FO多价血清作玻璃片凝集░,凡与多价O血清凝集者░,再与O因子血清凝集░,以确定所属别░,然后用H因子血清░,确定血清型。双向菌株应证实两相的H抗原░,有Vi抗原的菌型(伤寒和丙型副伤寒沙门氏菌)应用Vi因子血清检验。

  B4.3.2 生化试验

  应进行葡萄糖•●、甘露醇•●、麦芽糖•●、乳糖•●、蔗糖•●、靛基质•●、硫化氢•●、动力•●、尿素试验。沙门氏菌属中除伤寒沙门氏菌和鸡沙门氏菌不产气外░,通过发酵葡萄糖•●、产气•●、均发酵甘露醇和麦芽糖(但猪沙门氏菌•●、雏沙门氏菌不发酵麦芽糖)░,不分解乳糖•●、蔗糖░,尿素酶和靛基质为阴性░,通常产生硫化氢。除鸡•●、雏沙门氏菌和伤寒沙门氏菌的O型菌株无动力外░,通常均有动力。

  如遇多价O血清不凝集而一般生化反应符合上述情况时░,可加做侧金盏花醇•●、水杨素和试验░,沙门氏菌均为阴性。

  B5 检验结果报告

  根据检验结果░,报告一定体积的样品中存在或不存在沙门氏菌。

 3.2.3医疗机构污水及污泥中志贺氏菌的检验方法附录 C

  C1 仪器和设备

  C1.1 高压蒸汽灭菌器

  C1.2 干燥灭菌箱。

  C1.3 培养箱。

  C1.4 恒温水浴箱。

  C1.5 电炉。

  C1.6 天平。

  C1.7 灭菌平皿。

  C1.8 灭菌刻度吸管。

  C1.9 酒精灯。

  C2 培养基和培养液

  C2.1 革兰氏阴性增菌液(GN增菌液)

  C2.1.1 成分

  胰蛋白胨(或多价胨) 20g

  葡萄糖 1g

  甘露醇 2g

  枸橼酸钠 5g

  去氧胆酸钠 0.5g

  磷酸氢二钾 16g

  磷酸二氢钾 2.5g

  氯化钠 5g

  蒸馏水 1000mL

  C2.1.2 制法

  将以上各成分加入蒸馏水中溶化░,调整pH至7.0░,煮沸过滤░,115℃下灭菌20min.贮存于冷暗处备用。

  C2.2 二倍浓度革兰氏阴性增菌液(二倍浓度GN增菌液)

  C2.2.1 成分

  除蒸馏水改为500mL外░,其它成分同附录C2.1.1.

  C2.2.2 制法

  制法同附录C2.1.2.

  C2.3 SS培养基

  同附录B2.3.

  C2.4 伊红美蓝琼脂培养基(EMB培养基)

  同附录A2.3.

  C2.5 三糖铁琼脂(TSI培养基)

  同附录B2.5.

  C2.6 志贺氏菌诊断血清

  C3 检验程序

检验程序见图C.(略)

  C4 操作步骤

  C4.1 样品处理和增菌培养

  C4.1.1 污水

  取200mL污水░,用灭菌滤膜进行抽滤。用100mL二倍浓度GN增菌液把滤膜上截留的杂质洗脱到已灭菌的三角烧瓶内░,摇匀░,置于37℃恒温培养箱░,增菌培养6~8h.

  注:若样品为经过氯消毒的污水░,应在采样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。

  C4.1.2 污泥

  取污泥30g░,放入灭菌容器内░,加入300mL灭菌水░,充分混匀制成1:10混悬液。吸取上述1:10混悬液100mL░,加入到装有100mL二倍浓度GN增菌液的已灭菌的三角烧瓶内░,搅匀░,置于37℃恒温培养箱中░,增菌培养6~8h.

  注:若样品为经过氯消毒的污泥░,应在采样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。

  C4.2 分离

  取上述增菌培养液░,分别接种SS培养基平板和EMB培养基平板░,置于37℃培养箱中培养24h.

  挑取在SS培养基平板和EMB培养基平板上呈无色透明░,直径1~1.5mL的可疑肠道病原菌菌落。每个平板最少挑取5个菌落░,接种于TSI培养基░,置于37℃培养箱中培养18~24h.

  挑取在TSI中░,葡萄糖产酸不产气░,无动力░,不产生硫化氢░,上层斜面乳糖不分解的菌株░,可做血清学和生化试验。

  C4.3 鉴定

  C4.3.1 血清学试验

  志贺氏菌属分为四个░,先与多价血清作玻璃片凝集试验░,如为阳性░,再分别与A•●、B•●、C•●、D血清凝集░,并进一步与分型血清做玻璃片凝集░,最后确定其血清型。

  C4.3.2 生化试验

  应进行葡萄糖•●、甘露醇•●、麦芽糖•●、乳糖•●、蔗糖•●、靛基质•●、硫化氢•●、动力•●、尿素试验。志贺氏菌属能分解葡萄糖░,但不产气(福氏志贺氏菌6型有时产生少量气体)░,一般不能分解乳糖和蔗糖░,宋内氏志贺氏菌对乳糖和蔗糖迟缓发酵产酸。志贺氏菌属均不产生硫化氢░,不分解尿素░,无动力。对甘露醇•●、麦芽糖的发酵及靛基质的产生░,则因菌株不同而异。

  如遇多价血清玻璃片凝集试验为阴性░,而生化反应符合上述情况时░,可加做肌醇•●、水杨酸•●、V-P•●、橼酸盐•●、等试验。志贺氏菌属均为阴性反应。

  C5 检验结果报告

  根据检验结果░,报告一定体积的样品中存在或不存在志贺氏菌。

3.3 PH测定

3.1  适用范围

3.1.1本方法适用于饮用水•●、地面水及工业废水pH的测定。

3.1.2水的颜色•●、浊度•●、胶体物质•●、氧化剂•●、还原剂及较高含盐量均不干扰测定;但在pH小于1的强酸性溶液中░,会有所谓酸误差░,可按酸度测定;在pH大于10的碱性溶液中░,因有大量钠离子存在░,产生误差░,使读数偏低░,通常称为钠差。消除钠差的方法░,除了使用特制的低钠差电极外░,还可以选用与被测溶液的pH值相近似的标准缓冲溶液对仪器进行校正。

     温度影响电极的电位和水的电离平衡。须注意调节仪器的补偿装置与溶液的温度一致░,并使被测样品与校正仪器用的标准缓冲溶液温度误差在±10C之内。

  定义

  原理

     以玻璃电极为指示电极░,以Ag/AgCl等为参比电极合在一起组成pH复合电极。利用pH 复合电极电动势随氢离子活度变化而发生偏移来测定水样的pH值。复合电极pH计均有温度补偿装置░,用以校正温度对电极的影响░,用于常规水样监测可准确至0.1pH单位。较精密仪器可准确到0.01pH单位。为了提高测定的准确度░,校准仪器时选用的标准缓冲溶液的pH值应与水样的pH值接近。

  试剂

3.4.1标准缓冲溶液的配制方法

3.4.1.1试剂和蒸馏水的质量

3.4.1.1.1在分析中░,除非另作说明░,均要求使用分析纯或优级纯试剂。购买经中国计量科学研究院检定合格的袋装pH标准物质时░,可参照说明书使用。

3.4.1.1.2配制标准溶液所用的蒸馏水应符合下列要求:煮沸并冷却•●、电导率小于2×106S/cm的蒸馏水░,其pH以6.7-7.3之间为宜。

3.4.1.2测量pH时░,按水样呈酸性•●、中性和碱性三种可能░,常配制以下三种标准溶液:

3.4.1.2.1pH标准溶液甲(pH4.008, 250C)称取先在110-1300C干燥2-3小时的邻苯二甲酸氢钾10.12克, 溶于水并在窜量瓶中稀释至1升。

3.4.1.2.2pH标准溶液乙(pH6.865, 250C)分别称取先在110-1300C干燥2-3小时的磷酸二氢钾3.388克和磷酸氢二钠3.533克,溶于水并在窜量瓶中稀释至1升。

3.4.1.2.3pH标准溶液丙(pH4.008, 250C)为了使晶体具有一定的民,应称取与饱和溴化钠溶液共同放置在干燥器中平衡两昼夜的硼砂3.80克,溶于水并在一瓶中稀释至1升.

3.4.1标准溶液的保存

3.4.1.1标准溶液要在聚乙烯瓶或硬质玻璃瓶中密闭保存.

3.4.1.2在室温条件下标准溶液一般以保存1-2个月为宜, 当发现有浑浊•●、发霉或沉淀现象时░,不能继续使用。

3.4.1.3在40C冰箱内存放░,且用过的标准溶液不允许再倒回去░,这样可延长使用期限。

3.5  仪器

2.5.1酸度计。常规检验使用的仪器░,至少应当精确到0.1 pH单位░,pH范围从0-14。如有特殊需要░,应使用精度更主的仪器。

3.5.2复合电极

3..6  样品保存

     现场测定。否则░,应在采样后把样品保持在0 -4度░,并在采样后6小时之内进行测定。

3.7  步骤

32.7.1仪器校准:操作程序按仪器使用说明书进行.先将水样与标准溶液高速到同一温度, 记录测定温度, 并将仪器温度补偿旋钮调至该温度上。用标准溶液校正仪器░,该标准溶液与水样pH相差不超过2个pH单位。从标准溶液中取出电极░,彻底冲洗并用滤纸吸干。再将电极浸入第二个标准溶液中░,其pH大约与第一个标准溶液相差3个pH单位░,如果仪器响应的示值与第二个标准溶液的pH(S)值之差大于0.1 pH单位░,就要检查仪器•●、电极或标准溶液是否存在问题。当三者均正常时░,方可用于测定样品。

3.7.2样品测定

    测定样品时░,先用蒸馏水认真冲洗电极░,再用水样冲洗░,然后将电极浸入样品中░,小心摇动或进行搅拌使其均匀░,静置░,待读数稳定时记下pH值。

  注意事项

3.8.1电极在测量前必须用已知pH值的标准缓冲溶液进行定位校准░,为取得更正确的结果░,已知pH值要可靠░,而且其pH值愈接近被测值愈好。

3.8.2取下帽后要注意░,在塑料保护栅内的敏感玻璃泡不与硬物接触░,任何破损和擦毛都会使电极失效。

3.8.3测量完毕░,不用时应将电极保护帽套上░,帽内应放少量补充液░,以保持电极球泡的湿润。

3.8.4复合电极的外参比补充液为3M溶液(附件有:内装3M小瓶一只░,用户只需加入20ml蒸馏水摇匀░,此溶液即为外参比补充液)░,补充液可以从上端小孔加入。

3.8.5电极的引出端░,必须保持清洁和干燥░,绝对防止输出两端短路:否则将导致测量结果失准或失效。

3.8.6电极应输入阻抗较高的酸度计(≥1012Ω)配套░,能使电极保持良好的特性。

3.8.7电极避免长期浸在蒸馏水中或蛋白质溶液和酸性氟化物溶液中░,并防止和有机硅油脂接触。

3.8.8电极经长期使用后░,如发现梯度略有降低░,则可把电极下端浸泡在4%HF()中3—5秒钟░,用蒸馏水洗净░,然后在溶液中浸泡░,使之复新。


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